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HJ1001-2018水質三種大腸菌群測定酶底物法全文查看

發(fā)布時間：2019-10-16 11:50:00　　來源：優(yōu)爾普儀器　　瀏覽量：756

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，預計閱讀時間11分鐘

關鍵詞：酶底物法檢測（m.hongcheng168.net）

[摘要]：2018年生態(tài)環(huán)境部發(fā)布了HJ1001-2018環(huán)境保護標準

，標準是關于水質總大腸菌群、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌的測定-酶底物法

，本文和大家分享此標準的全部內容。

　　為貫徹《中華人民共和國環(huán)境保護法》和《中華人民共和國水污染防治法》，保護生態(tài)環(huán)境

，保障人體健康

，規(guī)范水中總大腸菌群、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌的測定方法

，我國生態(tài)環(huán)境部制定了本標準

。下面優(yōu)爾普儀器就和大家分享一下該標準的發(fā)布稿全文。

水質總大腸菌群
、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌的測定酶底物法

Water quality—Determination of total coliforms, fecal coliforms and Escherichia coli—Enzyme substrate method

1 適用范圍

本標準規(guī)定了測定水中總大腸菌群、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌的酶底物法

。

本標準適用于地表水、地下水

、生活污水和工業(yè)廢水中總大腸菌群

、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌的測定

。

本方法的檢出限為10MPN/L。

2 規(guī)范性引用文件

本標準引用了下列文件或其中的條款

。凡是不注日期的引用文件，其有效版本適用于本標準

。

GB/T 6682 分析實驗用水規(guī)格和實驗方法

GB/T 14581 水質湖泊和水庫采樣技術指導

HJ 494 水質采樣技術指導

HJ/T 91 地表水和污水監(jiān)測技術規(guī)范

3 術語和定義

下列術語和定義適用于本標準

。

3.1 總大腸菌群 total coliforms

37℃培養(yǎng) 24 h，能產生β-半乳糖苷酶(β-D-galactosidase)

，分解選擇性培養(yǎng)基中的鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)生成黃色的鄰硝基苯酚的腸桿菌科細菌。

3.2 糞大腸菌群 fecal coliforms

又稱耐熱大腸菌群(thermotolerant coliforms)

。44.5℃培養(yǎng) 24 h，能產生β-半乳糖苷酶(β-D-galactosidase)

，分解選擇性培養(yǎng)基中的鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)生成黃色的鄰硝基苯酚的腸桿菌科細菌

。

3.3 大腸埃希氏菌 Escherichia coli

俗稱大腸桿菌

。37℃培養(yǎng) 24 h

，能產生β-半乳糖苷酶(β-D-galactosidase)

，分解選擇性培養(yǎng)基中的鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)生成黃色的鄰硝基苯酚

，同時產生β-葡萄糖醛酸酶(β-Glucuronidase)，分解選擇性培養(yǎng)基中的 4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷2(MUG)釋放出熒光物質(4-甲基傘形酮)的腸桿菌科細菌

。

3.4 最大可能數(shù) most probable number(MPN)

又稱稀釋培養(yǎng)計數(shù)，是一種基于泊松分布的間接計數(shù)法

。利用統(tǒng)計學原理

，根據(jù)一定體積不同稀釋度樣品經培養(yǎng)后產生的目標微生物陽性數(shù)，查表估算一定體積樣品中目標微生物存在的數(shù)量(單位體積存在目標微生物的最大可能數(shù))

。

4 方法原理

在特定溫度下培養(yǎng)特定的時間，總大腸菌群

、糞大腸菌群、大腸埃希氏菌能產生β-半乳糖苷酶

，將選擇性培養(yǎng)基中的無色底物鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)分解為黃色的鄰硝基苯酚(ONP);大腸埃希氏菌同時又能產生β-葡萄糖醛酸酶

，將選擇性培養(yǎng)基中的 4- 甲基傘形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷(MUG)分解為 4-甲基傘形酮

，在紫外燈照射下產生熒光

。統(tǒng)計陽性反應出現(xiàn)數(shù)量

，查 MPN 表

，分別計算樣品中總大腸菌群

、糞大腸菌群

、大腸埃希氏菌的濃度值

。

5 干擾和消除

5.1 活性氯具有氧化性

，能破壞微生物細胞內的酶活性，導致細胞死亡

，可在樣品采集(8.1)時加入硫代硫酸鈉溶液(6.4)消除干擾。

5.2 重金屬離子具有細胞毒性

，能破壞微生物細胞內的酶活性，導致細胞死亡

，可在樣品采集(8.1)時加入乙二胺四乙酸二鈉溶液(6.5)消除干擾。

6 試劑和材料

除非另有說明

，分析時均使用符合國家標準的分析純試劑

，實驗用水應滿足 GB/T 6682中三級水的要求。

6.1 培養(yǎng)基

。

本標準采用 Minimal Medium ONPG-MUG 培養(yǎng)基

。每100 ml樣品需使用培養(yǎng)基粉末2.7 g±0.5 g

，所含基本成分如下：

培養(yǎng)基成分

也可采用市售商品化培養(yǎng)基制品

。

6.2 硫代硫酸鈉(Na2S2O3·5H2O)

。

6.3 乙二胺四乙酸二鈉(C10H14N2O8Na2·2H2O)

。

6.4 硫代硫酸鈉溶液：ρ(Na2S2O3)=0.10 g/ml

。

稱取 15.7 g 硫代硫酸鈉(6.2)

，溶于適量水中，定容至 100 ml

，臨用現(xiàn)配

。

6.5 乙二胺四乙酸二鈉溶液：ρ(C10H14N2O8Na2·2H2O)=0.15 g/ml

。

稱取 15 g 乙二胺四乙酸二鈉(6.3)

，溶于適量水中

，定容至 100 ml

，此溶液保質期為30d

。

6.6 97 孔定量盤：含 49 個大孔

，48 個小孔

。其中，每個小孔可容納 0.186 ml 樣品

，大孔中 48 個大孔每個可容納 1.86 ml 樣品

，一個頂部大孔可容納 11 ml 樣品

。也可采用經環(huán)氧乙烷滅菌的市售商品化成品

。

6.7 標準陽性比色盤

。

6.8 無菌水：取適量實驗用水

，經 121℃高壓蒸汽滅菌 20 min

，備用

。

7 儀器和設備

7.1 采樣瓶：具螺旋帽或磨口塞的 100 ml

、250 ml

、500 ml 廣口玻璃瓶

。

注：在采集不存在或不考慮余氧

、金屬離子干擾的樣品時

，可采用市售無菌采樣瓶或無菌采樣袋

。

7.2 高壓蒸汽滅菌器：121℃可調

。

7.3 恒溫培養(yǎng)箱：允許溫度偏差 37℃±1℃、44.5℃±0.5℃

。

7.4 程控定量封口機：用于 97 孔定量盤(6.6)的封口。

立科程控定量封口機

7.5 紫外燈：365～366 nm

。

7.6 移液管：1 ml±0.01 ml

、10 ml±0.1 ml

。也可采用計量合格的可調式移液器

。

7.7 三角瓶：100 ml

。

7.8 量筒：100 ml±1 ml

。

7.9 一般實驗室常用儀器和設備

。

注：三角瓶

、移液管、采樣瓶等玻璃器皿及采樣器具要在試驗前按無菌操作要求包扎

，121℃高壓蒸汽滅菌 20 min，烘干

，備用。

8 樣品

8.1 樣品采集

點位布設及采樣頻次按照 GB/T 14581

、HJ/T 494 和 HJ/T 91 的相關規(guī)定執(zhí)行

。

采集微生物樣品時

，采樣瓶(7.1)不得用樣品洗滌

，采集樣品于滅菌的采樣瓶中

。

采集河流

、湖庫等地表水樣品時

，可握住瓶子下部直接將帶塞采樣瓶插入水中

，約距水面 10～15 cm 處

，瓶口朝水流方向

，拔瓶塞

，使樣品灌入瓶內然后蓋上瓶塞

，將采樣瓶從水中取出

。如果沒有水流，可握住瓶子水平往前推

。采樣量一般為采樣瓶容量的 80%左右。樣品采集完畢后

，迅速扎上無菌包裝紙。

從龍頭裝置采集樣品時

，不要選用漏水龍頭

，采水前將龍頭打開至最大

，放水 3～5 min

，然后將龍頭關閉，用火焰灼燒約 3 min 滅菌或用 70%～75%的酒精對龍頭進行消毒

，開足龍頭，再放水 1 min

，以充分除去水管中的滯留雜質。采樣時控制水流速度

，小心接入瓶內

。

采集地表水

、廢水樣品及一定深度的樣品時，也可使用滅菌過的專用采樣裝置采樣

。

在同一采樣點進行分層采樣時，應自上而下進行

，以免不同層次的攪擾

。

如果采集的是含有活性氯的樣品，需在采樣瓶滅菌前加入硫代硫酸鈉溶液(6.4)

，以除去活性氯對細菌的抑制作用(每 125 ml 容積加入 0.1 ml 的硫代硫酸鈉溶液);如果采集的是重金屬離子含量較高的樣品

，則在采樣瓶滅菌前加入乙二胺四乙酸二鈉溶液(6.5)

，以消除干擾(每 125 ml 容積加入 0.3 ml 的乙二胺四乙酸二鈉溶液)

。

注：15.7 mg 硫代硫酸鈉(6.2)可去除樣品中 1.5 mg 活性氯

，硫代硫酸鈉用量可根據(jù)樣品實際活性氯量調整

。

8.2 樣品保存

采樣后應在 2 h 內檢測，否則

，應 10℃以下冷藏但不得超過 6 h。實驗室接樣后

，不能立即開展檢測的，將樣品于 4℃以下冷藏并在 2 h 內檢測

。

9 分析步驟

9.1 樣品稀釋

根據(jù)樣品污染程度確定接種量(見表 1)

，避免接種樣品培養(yǎng)后 97 孔定量盤(6.6)出現(xiàn)全部陽性或全部陰性

。接種量小于 100 ml 時

，應稀釋樣品后接種，接種量為 10 ml 時

，取 10 ml 樣品加入到盛有 90 ml 無菌水(6.8)的三角瓶(7.7)中混勻制成 1:10 的稀釋樣品，其他接種量的稀釋樣品依次類推

。對于未知樣品，可選用多個接種量進行檢測

。

樣品接種量參考表

9.2 接種

量取 100 ml 樣品或稀釋樣品于滅菌后的三角瓶

，加入 2.7 g±0.5 g 培養(yǎng)基(6.1)粉末

，充分混勻

，完全溶解后，全部倒入 97 孔定量盤(6.6)內

，以手撫平 97 孔定量盤背面，趕除孔內氣泡

，然后用程控定量封口機(7.4)封口

。觀察 97 孔定量盤顏色，若出現(xiàn)類似或深于標準陽性比色盤(6.7)的顏色

，則需排查樣品、培養(yǎng)基

、無菌水等一系列因素后

，終止試驗或重新操作。

注：9.1

、9.2 步驟在野外操作時應避開明顯局部污染源，建議使用一次性手套

、口罩

、酒精燈等

。

9.3 培養(yǎng)

測定總大腸菌群和大腸埃希氏菌時

，將封口后的 97 孔定量盤放入恒溫培養(yǎng)箱(7.3)中37℃±1℃下培養(yǎng) 24 h。

測定糞大腸菌群時

，將封口后的 97 孔定量盤放入的恒溫培養(yǎng)箱中 44.5℃±0.5℃下培養(yǎng)24 h。

9.4 對照試驗

9.4.1 空白對照

每次試驗都要用無菌水(6.8)按照步驟 9.1～9.3 進行實驗室空白測定

。培養(yǎng)后的97孔定量盤不得有任何顏色反應，否則

，該次樣品測定結果無效

，應查明原因后重新測定

。

9.4.2 陰性和陽性對照

總大腸菌群

、大腸埃希氏菌、糞大腸菌群的陰性

、陽性菌株參考表 2。

陰性<div id= 、陽性菌株參考表" src="/ulppic/191016/1-191016120343M8.png" />

將標準菌株制成300～3000個/ml 的菌懸液，將菌懸液按接種(9.2)和培養(yǎng)(9.3)要求操作

，陽性菌株應呈現(xiàn)陽性反應;陰性菌株呈現(xiàn)陰性反應

，否則

，該次樣品測定結果無效

，應重新測定。

注：可先制備較高濃度菌懸液

，采用血球計數(shù)器在顯微鏡下對其濃度進行初步測定，然后根據(jù)實際情況用無菌水(6.8)稀釋至 300～3000 個/ml

。

9.4.3 結果判讀與計數(shù)

將培養(yǎng)24h后的97孔定量盤進行結果判讀

，樣品變黃色判斷為總大腸菌群或糞大腸菌群陽性;樣品變黃色且在紫外燈(7.5)照射下有藍色熒光

，判斷為大腸埃希氏菌陽性

。如果結果可疑

，可延長培養(yǎng)至28h進行結果判讀

，超過 28 h 后出現(xiàn)的顏色反應不作為陽性結果?div id="jpandex" class="focus-wrap mb20 cf">？墒褂帽Ｙ|期內的標準陽性比色盤以輔助判讀，參見附錄 A

。

分別記錄97孔定量盤中大孔和小孔的陽性孔數(shù)量。

10 結果計算與表示

10.1 結果計算

從97孔定量盤法MPN表中查得每100ml樣品中總大腸菌群

、糞大腸菌群數(shù)或大腸埃希氏菌的MPN值(置信區(qū)間參見附錄C)后

，再根據(jù)樣品不同的稀釋度

，按照公式(1)換算樣品中總大腸菌群

、糞大腸菌群數(shù)或大腸埃希氏菌濃度(MPN/L)：

大腸菌群濃度計算公式

10.2 結果表示

測定結果保留兩位有效數(shù)字，當測定結果≥100 MPN/L 時

，以科學計數(shù)法表示;若 97孔均為陰性，可報告為總大腸菌群

、糞大腸菌群數(shù)或大腸埃希氏菌未檢出或<10 MPN/L。

11 精密度和準確度

11.1 精密度

6 個實驗室分別對低濃度(地下水

，濃度均值為 6.0×100MPN/L)

、中濃度(地表水

，濃度均值為 4.0×10000 MPN/L)和高濃度(生活污水

，濃度均值為 9.0×10000000MPN/L)三個不同濃度細菌總數(shù)的樣品及有證標準樣品(濃度為 2000 MPN/L)進行了 6 次重復測定：實驗室內相對標準偏差范圍分別為 0.26%～1.3%、0.65%～2.0%

、1.3%～3.7%和 0.68%～2.8%;實驗室間相對標準偏差分別為 9.9%

、1.3%、4.2%和 1.3%;重復性限為 0.17

、0.18、0.21 和 0.18;再現(xiàn)性限為 1.8

、0.23

、0.38 和 0.20;實驗室間置信區(qū)間見表 3

。

總大腸菌群實驗室間95%置信區(qū)間表

6個實驗室分別對低濃度(地下水

，濃度均值為70MPN/L)、中濃度(地表水

，濃度均值為 9.0×1000MPN/L)和高濃度(生活污水，濃度均值為 2.0×1000000MPN/L)三個不同濃度細菌總數(shù)的樣品及有證標準樣品(濃度為 2000MPN/L)進行了 6 次重復測定：實驗室內相對標準偏差范圍分別為 0.69%～1.9%

、0.93%～2.9%、5.4%～21%和 1.8%～3.0%;實驗室間相對標準偏差分別為 9.6%

、1.6%

、15%和 3.7%;重復性限為 0.23、0.21

、0.58 和 0.19;再現(xiàn)性限為 1.7、0.26

、0.90 和 0.35;實驗室間置信區(qū)間見表 4

。

大腸埃希氏菌實驗室間置信區(qū)間表

6個實驗室分別對低濃度(地下水

，濃度均值為 1.0×100MPN/L)

、中濃度(地表水

，濃度均值為 1.3×10000MPN/L)和高濃度(生活污水

，濃度均值為 3.0×1000000MPN/L)三個不同濃度細菌總數(shù)的樣品及有證標準樣品(濃度為3700MPN/L)進行了 6 次重復測定：實驗室內相對標準偏差范圍分別為 0.40%～2.4%、1.3%～2.9%

、3.4%～17%和 2.4%～9.2%;實驗室間相對標準偏差分別為 8.9%

、6.4%、6.6%

、6.4%;重復性限為 0.22

、0.26、0.58 和 0.55;再現(xiàn)性限為 1.6

、0.76

、0.64 和 0.75;實驗室間置信區(qū)間見表 5

。

糞大腸菌群實驗室間置信區(qū)間表

11.2 準確度

6家實驗室對總大腸菌群有證標準樣品(2000 MPN/L)進行了 6 次重復測定：實驗室內的相對誤差范圍為-6.4%～-3.5%;相對誤差的最終值為-4.7%±1.2%

。

6家實驗室對大腸埃希氏菌群標準樣品(2000 MPN/L)進行了 6 次重復測定：實驗室內的相對誤差范圍為-15%～-6.3%;相對誤差的最終值為-13%±3.3%

。

6家實驗室對糞大腸菌群的有證標準樣品(3700 MPN/L)進行了 6 次重復測定：實驗室內的相對誤差范圍為-17%～-0.81%;相對誤差的最終值為-13%±6.1%。

注：微生物檢測數(shù)據(jù)為偏態(tài)分布

，其測定結果全部經以 10 為底對數(shù)轉換后進行計算

。

12 質量保證和質量控制

12.1 每批樣品按對照試驗(9.4)進行空白對照測定，定期使用有證標準菌株進行陽性和陰性對照試驗

。

12.2 每 20 個樣品或每批次樣品(≤20 個/批)測定一個平行雙樣。

12.3 對每批次培養(yǎng)基須使用有證標準菌株進行培養(yǎng)基質量檢驗

。

12.4 定期使用有證標準菌株/標準樣品進行質量控制

。

13 廢物處理

實驗中產生的廢物經 121℃高壓蒸汽滅菌 20 min 后，作為一般廢物處理

。

總大腸菌群、糞大腸菌群酶底物法陰性<div id=

、陽性結果參考圖" src="/ulppic/191016/1-191016124955925.png" />

大腸埃希氏菌酶底物法陰性<div id=

、陽性結果參考圖" src="/ulppic/191016/1-191016125009216.png" />

　　以上就是HJ1001-2018水質總大腸菌群

、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌的測定酶底物法發(fā)布稿標準的全部內容了

，有需要的朋友可以參考。

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